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核酸探針法檢測(cè)對(duì)蝦疫病

84農(nóng)業(yè)網(wǎng)　　時(shí)間：2018-03-14 　　作者：佚名　　來源：網(wǎng)絡(luò)整理

1、樣品采集標(biāo)準(zhǔn)方法

1.1　采樣器具：眼科剪刀、眼科鑷、牙刷、樣品容器(1.5毫升塑料離心管、5―10毫升青霉素小瓶、5―10毫升小試管、5―20克小藥瓶等小型具塞容器均可)、標(biāo)簽紙、鉛筆、樣品記錄(記錄簿或紙張)、燒杯或水杯、滴管、SEMP采樣液、l摩爾／升HCl、1％一5％新配制的高錳酸鉀或漂白粉。

1.2　采樣部位

1.2.1　親蝦：瀕臨死亡的親蝦或己冰凍的親蝦，采取少量蝦胃，每樣品重0.1―2克。

1.2.2　各生長(zhǎng)期對(duì)蝦：采集蝦胃，對(duì)于3厘米以下樣品可取蝦頭。每樣品在0.1―2克。

1.3　操作步驟

1.3.1　清洗干凈各種器具、采樣容器(用過的容器清洗后，用1摩爾／升HCl浸泡2小時(shí)，再充分洗凈)。

1.3.2　預(yù)先在每個(gè)采樣容器中加入0.5毫升的SEMP采樣液。

1.3.3　各種與樣品直接接觸的金屬器具在用于處理下一個(gè)樣品前都必須用牙刷刷洗干凈后，在5％新配制的高錳酸鉀或漂白粉溶液中浸泡5分鐘以上，再用清水洗滌干凈后使用，以消除交叉污染。

1.3.4　按上述樣品采集重量要求用鑷子、剪刀采集樣品，放入采樣容器中，與采樣液混勻。一份樣品放入一個(gè)采樣容器。不能互混。

1.3.5　用鉛筆在標(biāo)簽上寫上編號(hào)，放入采樣容器內(nèi)或牢固地粘在采樣容器上。

1.3.6　在樣品記錄上詳細(xì)寫明①樣品編號(hào)，②樣品種類名稱，③個(gè)體數(shù)量，④采集地點(diǎn)，⑤采集時(shí)間，⑥保存方法，⑦現(xiàn)場(chǎng)問題，⑧采樣單位，⑨采樣人。

2、需自備的器材和物品

扁頭鑷子1把，剪刀1把，碾磨棒1個(gè)，微型臺(tái)式離心機(jī)1臺(tái)，吸水紙1合，80℃恒溫箱1臺(tái)，60℃、70℃水浴鍋1臺(tái)，朔料封口機(jī)1臺(tái)，電爐及杯子1只，泡末朔料板1塊，不透光盒子1個(gè)，計(jì)時(shí)器或手表1只，移液器或吸管若干，碎冰筷若干，蒸餾水、小燒杯、試管、橡皮塞、量筒若干。

3、準(zhǔn)備樣品

取樣品或蝦的胃置于微型離心管中，加入0.3mg研磨液，用研磨棒將樣品充分磨碎。

4、檢測(cè)操作

4.1　泡膜、點(diǎn)樣和交聯(lián)

4.1.1　泡膜：用蒸餾水和泡膜液分別泡雜交膜5和10分鐘，然后置于吸水紙上晾干。

4.1.2　樣品變性：將研磨好的樣品稍離心，分別取少量上清液置于微型離心管中，編號(hào)，注意加上陽性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品；填寫《樣品檢測(cè)結(jié)果記錄表》中的“樣品說明”欄。然后將所有樣品插在泡沫塑料板上，于100℃沸水中煮沸10分鐘；再迅速置于碎冰塊中2分鐘以上，直到點(diǎn)樣。

4.1.3　點(diǎn)樣：用點(diǎn)樣管吸取變性樣品上清，先點(diǎn)樣于測(cè)試膜的一個(gè)方格內(nèi)，再在參照膜相對(duì)應(yīng)的方格內(nèi)亦點(diǎn)樣，然后置于吸水紙上自然晾干。

4.1.4　交聯(lián)：將點(diǎn)樣后晾干的雜交膜夾于兩層吸水紙中間，在80℃恒溫箱中烘烤2小時(shí)。

4.2　預(yù)雜交和雜交

4.2.1　配制預(yù)雜交液：將封閉劑完全溶解于預(yù)雜交母液中配成預(yù)雜交液。

4.2.2　預(yù)雜交：將兩張雜交膜分別置于兩個(gè)雜交袋中分別加入配制好的預(yù)雜交液，用塑料封口機(jī)封口，注意趕盡袋中氣泡，檢查雜交袋是否密封，在70℃水浴中孵育0.5―2小時(shí)。

4.2.3　探針變性：將探針于100℃水浴煮沸10分鐘。立即置于冰水中2分鐘以上。

4.2.4　雜交：將變性的探針加入測(cè)試膜雜交袋中，封口，將兩雜交袋在70℃水浴中繼續(xù)孵育過夜。

4.3　加入抗體

4.3.1　洗滌：用清洗液I將測(cè)試膜和對(duì)照膜洗滌2次，每次5分鐘。

4.3.2　洗滌：用清洗液II將測(cè)試膜和對(duì)照膜洗滌2次，在60℃水浴中，每次15分鐘。

4.3.3　洗滌：用緩沖液A將兩張雜交膜洗滌2分鐘。

4.3.4　封閉：將兩張雜交膜分別置于兩個(gè)新的雜交袋中，分別加入封閉液，封口，室溫下放置30分鐘。

4.3.5　加入抗體：將抗體(抗―DIG―AP)加入兩雜交袋中，室溫振蕩30分鐘。

4.4　顯色、觀察和記錄結(jié)果

4.4.1　洗滌：用緩沖液A洗滌兩張雜交膜2次，每次15分鐘。

4.4.2　洗滌：用緩沖液B洗滌兩張雜交膜1次，2分鐘。

4.4.3　配制顯色液：將顯色劑A、B加入到緩沖液B中，混勻。

4.4.4　顯色：將兩張雜交膜分別置于兩個(gè)新的雜交袋中，分別加入顯色液，封口，置于暗盒中(或避光)顯色30分鐘至2小時(shí)。

4.4.5　終止顯色：顯色過程中可隨時(shí)取出雜交膜觀察顯色情況、觀察后立即放回暗處。當(dāng)測(cè)試膜上陽性對(duì)照樣品明顯出現(xiàn)顏色而雜交膜本底剛有所變色時(shí)，立即剪開顯色袋，倒去顯色液，取出雜交膜，在蒸餾水或自來水中漂洗15―30分鐘，終止顯色。

4.4.6　觀察、記錄：將雜交膜置于吸水紙上晾干，對(duì)光觀察結(jié)果，記錄，詳細(xì)填寫《樣品檢測(cè)結(jié)果記錄表》。如雜交膜上陰性對(duì)照樣也現(xiàn)色，則需重做。

5、結(jié)果判斷

根據(jù)雜交膜的顯色情況來判斷：以陽性對(duì)照樣顯出的顏色為標(biāo)準(zhǔn)，樣品的顏色與陽性對(duì)照顏色相同或相近，則樣品為病毒攜帶者；樣品的顏色比陽性對(duì)照顏色深，則樣品為已發(fā)病或臨死狀態(tài)；樣品不顯出顏色，則樣品為不帶病毒。

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