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84農業網 時間：2018-03-14 作者：佚名 來源：網絡整理
近年來，歐鰻的大規模集約化養殖已在我國日益增多。但是，隨著養殖規模的擴大，養殖密度的不斷提高，各種影響歐鰻成活率的問題也日漸增多，而由嗜水氣單胞菌作為病原的歐鰻暴發性傳染病則是其中一個突出問題。本文對嗜水氣單胞菌的生理生化特性、致病因子、致病條件等作了一系列的初步研究，旨在為歐鰻暴發性傳染病的防治提供有力的理論依據，更好地推動歐鰻養殖業向著更強、更快、更健康的方向發展。
一、材料與方法
1.病原菌的分離
采用普通蛋白瓊脂培養基，其成份為胰蛋白胨10g，酵母膏10g，氯化鈉5g，瓊脂18～20g，pH7.2～7.4，15磅20分鐘滅菌備用。
取患典型病癥的鰻魚，以無菌解剖刀將潰爛表層切開，以接種環迅速挑取少許病灶深層粘液，進行瓊脂平板劃線分離。28℃，24小時常規培養后，出現一些形態基本一致的菌落。挑取單菌落，進行純培養，然后轉接斜面備用。
2.致病性實驗
將實驗菌種接斜面，28℃培養約24小時，每個斜面中加入無菌生理鹽水5～10mL，制成濃厚菌懸液。取1mL菌懸液，以活菌平板計數法測定細菌數，吸取0.1mL菌懸液，注入健康鰻鱺腹腔中（注射前已置水族箱中觀察5天），同時設對照，置24～28℃水族箱中觀察其癥狀。
3.病原菌的形態觀察和生理生化實驗
采用致病力較強的菌株Ah3、Ah26、Ah38在28℃條件下，經24小時培養，進行革蘭氏染色，鞭毛染色，觀察其形態及其它生理生化實驗。
4.血清型研究
1）采用小白兔（從市場上購買）制備抗血清。攻毒用健康鰻魚（由養鰻場提供），規格為40～50g左右，試驗前觀察5～7天證實健康無病。
2）將具有強致病力的Ah3、Ah26、Ah38等菌株分別于營養瓊脂上培養24小時，刮取菌苔，用無菌生理鹽水沖洗菌體三次，將菌體分別用0.35%福爾馬林滅活25小時，制得全菌抗原（WC抗原），4℃冰箱保存備用；
3）以0.35%福爾馬林滅活體0.1mL（濃度為1×10E9cell/mL）加等量弗氏完全佐劑混合均勻，皮下多點免疫白兔，以后每隔一周耳靜脈加強免疫，并逐次加大抗原劑量，獲滿意效價后頸動脈放血取血清。
4）試管凝聚法：免抗血清（1∶60）稀釋0.25mL，加入0.25mL濃度為15R/mL抗原，充分搖勻，4℃，12小時，觀察其凝聚反應。
5.嗜水氣單胞菌毒力（LD50）測定
Ah菌株接種營養肉湯，28℃培養24小時，測菌濃度，用無菌生理鹽水10倍系列稀釋菌體，腹腔注射健康鰻鱺，實驗水溫25℃，記錄死魚數及注射菌量，按Reed－Muench法計算LD50。
6.溶血活力測定
將Ah菌株純分離物接種于10%兔血平板，28℃培養過夜，以溶血圈直徑與菌落之比示溶血活力。
7.致病條件的探索性測定
采用致病力較強的Ah38號菌株為攻毒菌株，調整水族箱內水體環境，使其含菌量大約為5～104cells/mL，在不同條件下，使健康鰻鱺浸浴其中，以觀察嗜水氣單胞菌的條件致病性。
二、實驗結果
1.本實驗共分離出菌株63株，其中經人工感染具有致病力的菌株有8株，在這8株菌中，又有3株菌的致病力是極強的。
2.病原菌的形態觀察及生理生化特性。
本實驗結果表明，我們從病魚中就分離到的Ah3、Ah6、Ah7、An26、Ah31、Ah38、Ah51、Ah53等菌株的形態、培養特性及生理生化反應基本一致，現以Ah38號菌株為代表簡述如下：
在營養瓊脂平板上，28℃，18～24小時培養菌落圓形、濕潤、表面光滑、低凸，邊緣整齊，半透明，乳白色，直徑1～1.5mm左右，有異味。在肉湯培養基中，28℃，18～24小時培養液均勻混濁，表面呈霧狀薄膜，一搖即散，在高倍顯微鏡下，呈兩端圓形的直桿菌，單個或成對，能運動，無芽胞，無莢膜，革蘭氏染色陰性，電鏡觀察有單生鞭毛。
根據這些培養特性，我們確認所分離到的菌株屬于嗜水氣單胞菌（Aeromonushydrophila），它們是引發歐洲鰻暴發性傳染病的主要病原，這一點已得到了大多數學者的一致公認。
3.我們以致病力實驗中致病能力較強的Ah3、Ah26、Ah38號菌株制備兔抗血清，并與其它5株Ah菌株進行了試管凝聚試驗，結果表明，Ah3與Ah38屬同一血清型，Ah26屬另一血清型，其余5株分屬這兩個血清型，反應專一性強，沒有發現能同時與兩種血清型反應的菌株。
4.嗜水氣單胞菌毒力（LD50）測定實驗結果向我們表明，八株Ah菌株對健康鰻鱺均有強的毒力，最強的Ah38號菌株，其LD50低于104CFU，同時，毒力強的菌株其菌溶血圈直徑與菌落直徑之比大于2，表明它有較強的溶血活力，其它LD50較低的菌株其溶血活力也較低。這個實驗結果啟示我們，嗜水氣單胞菌的毒力與其溶血活力有著一定的線性關系，不同血清型的菌株其溶血能力不一致，在我們的實驗中，以Ah38號菌株所代表的血清型有著更強的致病力，這為我們今后尋找防治嗜水氣單胞菌感染有效的用生物技術提供了一個新的思路。
5.嗜水氣單胞菌的條件致病性實驗結果表明，當水體中含有一定量的嗜水氣單胞菌時，假如魚體健康水質狀況良好，那么魚感染疾病的幾率是很小的；但當魚體本身受到一定的損害時，比如說，腮絲破損或表皮破損，尤其是鰓絲受到損害時，魚則很容易受細菌感染而發病；而當魚體受傷，水體環境亦差時，魚體的死亡速度和死亡率最高是不言自明的，正如我們的實驗所表示的那樣。
三、討論
嗜水氣單胞菌作為水中的固有菌群，由于它具有宿主范圍廣、感染力強等特點，而成為淡水魚類養殖業病害的主要病原之一。在實驗中所分離到的具有強致病力的Ah3、Ah26；Ah38號菌株分別代表著兩種不同的血清型，他們組成了引發江浙滬一帶淡水魚暴發性傳染病的主要病原；同時，毒力實驗和溶血活力實驗也表明，毒力強的菌株也有著較強的溶血活力。這似乎是嗜水氣單胞桿菌引起魚類大面積潰瘍出血的原因，這個結果與某些文獻報道結果基本一致。這些學者還認為嗜水氣單胞菌能引起魚體出血、溶血和死亡，其產生和溶血素、肉毒素和細胞毒素可能是致病因子有關。本實驗也表明，不同的菌株其毒性強弱是不同的。我們推測有的菌株只有一種毒性因子，有的則有多種，這與一些學者的某些觀點是一致的。
關于嗜水氣單胞菌的侵染途徑，我們初步推測是以腮為主要途徑，侵染后以肝臟為主要增殖部位，繼而再向全身彌漫性擴展，在本次實驗中，我們的致病菌株主要都由肝中分離得到，再感染后也以肝臟中出現病菌時間最早，說明嗜水氣單胞菌感染時還有一定的親嗜性。
氨氮亞硝酸鹽并不能為嗜水氣單胞菌的生長提供營養，但含量過高卻是導致魚類發病的重要環境因子。原因在于亞硝酸鹽氮能破壞機體血液的血紅蛋白，使紅血球失去攜氧能力，而氨氮除直接引起魚類中毒以外，還不斷分解產生亞硝酸鹽氮，從而使魚的抗病機能降低，容易受細菌的侵染而生病。在我們的實驗中，氨氮、亞硝酸鹽氮值僅為正常值的兩倍，鰻魚的死亡率即明顯高于對照組，也說明了這點。因此，我們初步認為，嗜水氣單胞菌作為引發淡水魚類暴發性傳染病的主要病原，屬于條件致病菌，它的傳染性與魚體的健康狀況和水體環境有關。近年來，大量涌現的文獻都報道，嗜水氣單胞菌的耐藥范圍和強度均在不斷拓廣和加強，且藥的殘留已對人類尤其是兒童的身體健康構成了嚴重威脅。在實踐工作中，我們就應把重點轉向控制養魚環境這個環節上來，保護水質，減少細菌的侵染途徑，才是防治魚病的根本。
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